由于实验设置了重复，我们还需要对相对定量值添加上下限，定量PCR软件对上下限的计算给出了两种算法。默认的算法是置信区间算法（Confidence Level Algorithm），这种算法基于实验中Ct值的统计学分布进行的区间估计。另一种可供选择的方法是基于标准差的算法（Standard Deviation Algorithm），这种方法计算相对简单，只需要计算出ΔΔCt的标准差值，是早期相对定量分析中提出的算法（KJ Livak,& TD Schmittgen, 2001）。我们分别来看这两种方法的计算上下限的过程。
首先来看置信区间算法，这里还是以刚才用到的比较Ct相对定量数据为例。该方法的细节推导详见文末的参考文献[2]，这里只展示计算的过程。
首先我们需要分别对每个样本中的目的基因和内参基因的Ct值都计算标准差，计算公式如下：
对每个样本，利用计算得到的目的基因和内参基因的标准差，进一步计算ΔCt的标准误差（ΔCtSE），公式如下：
其中，n1和n2是每个样本中靶基因和内参基因的复孔数目。
计算过程还需要用到给定置信区间下的t值，在靶基因与内参基因的复孔数均大于2的情况下，可以通过下式计算自由度:
-ΔΔCt置信水平为1-α的置信区间为
- ΔΔCt±tα/2(ν(ΔCt))× ΔCt SE
以常用的置信水平95%为例，对于本例中的样本，靶基因与内参基因的复孔数均为3，自由度即为ν(ΔCt)=3+3-2=4，需要计算t0.05/2(4)，可在Excel中由公式TINV(0.05, 4)给出，为2.776。依次计算上述各数值，最后得到RQ Min和RQ Max整理至下表：
表4.置信区间法相对定量上下限结果计算
在软件中，查看基于置信区间的上下限结果，可以看到，计算结果与上述计算一致。
图4.软件中置信区间法相对定量上下限结果计算
接下来是基于ΔΔCt的标准差的上下限计算。上述计算中，我们已经完成了每个样本中内参基因与目的基因的标准差计算。对于每个样本，由于ΔCt的计算需要同时用到目的基因和内参基因Ct值的均值，其标准差需要把内参基因和目的基因Ct的标准差同时考虑进来，这里以样本800为例，按下式计算：
计算ΔΔCt值时，由于直接使用了对照样品的ΔCt，认为其为一个固定数值，故认为对于单个实验样本，其ΔΔCt的标准差与ΔCt的标准差相等，如对样本800，有：
根据计算结果，对于每个样品，ΔΔCt值正负一个标准差值作为其上下限。以样品800为例，ΔΔCt,800为-0.766， 标准差为0.059，ΔΔCt,800的上下限为-0.766±0.059，可得到上限RQ Max对应的ΔΔCt值为-0.825，下限RQ Min对应的ΔΔCt为-0.707。利用2-ΔΔCt算法，算得RQ Max为1.771，RQ Min为1.632。利用相似的计算过程，可以完成对样品400及样本1600中RQ Max和RQ Min的计算，计算结果如下表：
表5.基于标准差的相对定量上下限结果计算
若在软件中查看这种算法的上下限结果，我们可以查看Analysis->Analysis Settings->Relative Quantification Settings下的RQ Min/Max Calculations选项，并将默认的Confidence Level选项改为Standard Deviations，上下限默认一个标准差，勾选1，如下图所示：
图5.QuantStudio Design&Analysis Desktop Software相对定量设置
回到Results界面下Relative Expression选项，查看软件给出的结果，上下限的计算结果与上述手动计算的结果一致。
图6.软件中基于标准差的相对定量上下限结果计算